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十八墒、制造超高速离心机的几种分离方法

 

十八感曹、制造超高速离心机的几种分离方法
    


   

  A.差速离心馅舒库:逐次增加离心力邻,每次可沉降样品溶液中的一些组份钱丝。
  差速离心是一种最常用的方法卫缴录。在这种方法中党凌,离心管在开始时装满了均一的样品溶液衅卷。通过在一定速度下一定时间的离心后骸,就可得到两个部份卞:沉淀和上清液肋揉昧。
  通常在第一次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉掀翔。这时所需的组份大部分仍留在上清液中悔劝。然后将收集到的上清液以更高速度离心侧,把所需的粒子沉积下来递处丢。离心的时间要选择得当痴钨袄,使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中词。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心攻拱磕,直到达到所需要的分离纯度为止娶。
  高速离心机差速离心的特点是操作简单趴,但分离纯度不高惫恨铝。

  B.密度梯度离心法阀漓隋:可以同时使样品中几个或全部组份分离床还,具有很好的分辨率蝗党。
  1)速率区带法(rate zonal)烤午萎:
  根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)雷规切。大致步骤如下监沪:
  在离心管中装入密度梯度溶液嚷,溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)俩陵开。
  将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部电弗。样品在梯度溶液表面形成一负梯度赴课龚。
  由于不同大小的粒子在离心力作用下茨,在梯度中移动的速度不一样剐汉慰,所以经过离心后会形成几条分开的样品区带错呐阀。
  注意捂:样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度挛嵌免。离心过程必须在区带到达管子底部前停止砷。
  2)等密度离心法(isopycnic)搪某:
  根据粒子的不同密度来分离辫。离心过程中佬川窍,粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带老屡梦。
  密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度肥饱彭。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中纯暖揪。经离心后烧你坷,样品粒子达到它们的平衡点辜。
  注意俄碧:平衡后粒子的分离完全由其密度决定皑典不,与时间无关钢珐,此时再改变离心转速勃彤邓,只能改变区带的相对位置氏。

  2.密度梯度分析法
  1)梯度介质性质与选择摧播:
  A瞧腥、应具备的性质 汞:
  梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求黔,一个理想的密度材料标准它应是试:
  所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围态副。
  具有某些性质心惭苫,如折射率乱嫉铆,据此可测定它的浓度搏费绣。
  所形成的溶液粘度低能。
  不损伤所分离的样品孝棉。
  离心分离后容易除去誊。
  不妨碍分离积分的分析仇芭。
  B焊、常用介质种类努:
  表一驰瞎、常用梯度材料在20℃密度
  B.梯度介质应用范围惟客攻:
  表二模纠、等密度梯度介质的应用
  表三睦焕、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度
  (2)灵、梯度溶液的准备够犯酶:
  计算
  稀释
 《臁(3)沮、梯度形状
  梯度形状分寺栋戈:线型刑钠、等速型慌榷孰、阶梯型想、平坦型柬推、陡峭型指数梯度户。
  梯度形状对于分离是否成功非常重要叭藉鄙:
  最常用的是线型梯度犁队默,适用于分离蛋白质笆、酶心馆驶、激素其秋灰、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型  适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度最适用于分离整细胞士、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒枪千。等速梯度以及长液柱可增进分离能力麓簧,适用于分离核糖体亚基喀鸡脊、多核糖体及植物病毒佩。
  B.梯度柱制备锹旦迟:
  梯度液柱可以用手工或梯度仪制备
  半注法彭谭仆:
  为缩减离心时间呛世摄,或分离样品较少可用半注法搐逼太:下半管铺置梯度介质拖,中间加样品瞬,上面铺  Buffer或液体石腊油韧。
 ×铡(4)臼、加样方法与加样量策烫登:
  将样品加到梯度液柱上享科,针尖和离心管成45-60°角度额闲,慢慢地将样品沿管壁流到液面上去规蟹补,对于DNA一类易断的脆弱样品前够逝,应该用孔径较大的移液管代替针头琅细吝,以避免剪切力对样品的切割作用拷。样品浓度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)等。
 《狻(5)箍磁、转子的选择与效应琳半尚:
 ∥楹搿(6)脓、分离区带的回收及检测
  离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种饯罐换:
  a.穿刺法
  穿刺离心管底部鞍坚么,使梯度溶液滴出胃患,将一具有合适阀门的盖帽放在离心管顶靶,可控制滴出速度抄佰容。
  b.虹吸法闹:
  将一毛细管轻轻插入管底卑,尽量防止梯度抖动舱驴筹,用微量泵逐渐滴鹊∧埂,以一定量滴数或体积部分收取梨狈波。
  c.加压法欧抒瞧:
  通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部泄,部分收集换出的溶液措躺炕。
  d.切割法估脸貉:
  采用专用的切割刀切割所需区带缔。
  区带检测媒咎:
  所谓区带检测啡频,实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测秘偶,通常只是测量在260或280mm时长的吸收值肚,以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布位递,这个操作通常称之为在线(on line)监测方蒋促。


 

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